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開學季技術大講堂——(二)抗體的選擇
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2019-9-23

隨著生命科學的發展,圍繞蛋白進行的研究越來越多,抗體試劑在實驗中的重要性越來越舉足輕重。面臨著紛呈復雜的抗體試劑市場,如何選擇到適合自己實驗的抗體就變得尤為重要。

一、一抗選擇需要確定或參考的信息

(一)目的蛋白的信息

確定想檢測的目的蛋白是否與抗體識別蛋白信息吻合,注意中英文名字、別名等信息。

某些蛋白具有多種不同的亞型,這需要在選擇抗體之前確定要研究的蛋白亞型。還有些抗體由于其抗原選擇的是不同蛋白亞型共有的肽段區域,是可以同時識別多個亞型的。有的蛋白通過剪切加工才能轉變為成熟的活性形式,如Caspase、Insulin等,這就需要根據研究需要,選擇針對前體或成熟形式的特異性抗體。

(二)抗體制備所用抗原的信息

抗體是由各種不同抗原免疫宿主而制備得來,抗原類型包括:全長蛋白、蛋白片段、多肽、全有機體(如:細菌)或細胞,抗體說明書一般都有制備抗體所用抗原的描述。在有些情況下,需要查閱抗體制備相關抗原信息來選擇抗體。比如,針對重組表達蛋白選擇抗體,如果是表達部分蛋白片段,則需要注意抗體的抗原區域是否在該片段區域內。某些特殊蛋白(如病原體蛋白)未經過內部驗證種屬的目的蛋白,需要求助生產商進行蛋白同源性序列比對,并結合制備抗體所用的抗原序列,查看交叉反應的情況。

(三)修飾位點的信息

在選擇合適的抗體用于特定修飾位點研究時,需要特別注意,不同位點的修飾可能有不同的機制存在,不宜一概而論。有關不同修飾位點的功能,可以通過查閱文獻確定。另外,由于有的蛋白存在不同亞型且序列高度同源,而不同亞型的某些磷酸化修飾位點周圍的序列完全相同,因此針對這些保守的修飾位點的抗體往往會同時識別不同亞型的相似修飾位點。

(四)實驗樣本的種屬信息

抗體一般會在出廠前對常見的不同種屬目標樣本進行內部驗證,以確定可以滿足的不同種屬類型,可以在產品說明書的Species-Reactivity一欄中看到(如人、小鼠、大鼠等)。通過驗證,達到質檢要求的種屬會明確標記,以備參考。沒有做過關于這些種屬的實驗,所以不建議使用。一些沒有標明的種屬,也有可能是可以應用的,建議通過聯系抗體公司技術支持來獲得相關抗原序列比對的信息,根據蛋白同源性的情況以確定是否可以用于該種屬的樣本。為了避免實驗風險,盡量不要使用說明書中沒有提及的標本的種屬的抗體。

(五)抗體應用的實驗類型

抗體一般會在出廠前對常見的抗體應用(WB、IP、ChIP、IHC、IF、FCM)進行內部驗證,以確定是否可以滿足不同應用要求。通過驗證,達到質檢要求的抗體會明確標記,以備參考。一些沒有標明的應用,往往是因為經過驗證沒有達到質檢標準而不推薦,千萬不要根據經驗或常識去推測某個抗體的應用。比如,有的客戶會認為,既然某個抗體可以用于IHC,根據經驗推斷應該可以用于IF,但畢竟這是不同的兩個應用,這樣做可能會浪費很多時間和試劑而不能獲得結果。抗體廠家不推薦您使用沒有標明的應用,可以挑選其他的貨號,可能有適用于這個應用的更好的其它產品。如果抗體說明書沒有提及的應用類型,并不意味著該抗體不適用于此種應用類型,而僅是說明尚未經過此種應用的內部驗證。為了避免實驗風險,當說明書中沒有提及的應用方法時,可向生產商申請試用裝,進行初步預實驗后,再決定是否購買。

(六)標記物的信息

有一些實驗,如多重免疫熒光、多指標流式測定可能會使用到直接標記的一抗(簡稱直標一抗)。在進行直標一抗選擇時,需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍,針對不同的參數要求選擇合適的標記物。在設計多重實驗時,應考慮每種熒光基團的獨特性質,如最大吸收波長和最大發射波長,消光系數和斯托克斯位移等因素。有關標記物選擇的細節,我們將在后面的免疫熒光與流式技術部分詳加介紹。

(七)文獻引用情況

有的時候,針對某一個蛋白可能有不同貨號的產品,很多人喜歡通過查閱文獻來確定自己將要選擇的抗體貨號是否有過較好的表現。一般抗體公司都會收集引用自己產品的文獻,這些產品都是經過SCI驗證過的,所以大可放心的使用。不過,也不排除抗體公司近期生產出更好的抗體,可以向公司咨詢。


二、二抗選擇需要確定或參考的信

(一)一抗的來源種屬

主要根據一抗來源種屬而決定二抗來源,如一抗是小鼠來源,那二抗就買抗小鼠的即可。

(二)二抗應用的實驗類型

針對不同的實驗應用,需要考慮二抗所偶聯的標記物,如HRP、Biotin、熒光素等標記物。WB與IHC所用的二抗,所帶的標記物主要選擇HRP和Biotin,而免疫熒光和流式應用可根據實驗設計的需要,選擇不同熒光素標記的二抗,如FITC、Cy3、PE等。



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